پروتکل آزمایشی
استفاده از Oligo (dT)18 یا پرایمر اختصاصی:
- آمادهسازی واکنش:
- نمونه RNA و پرایمرها را روی یخ ذوب کنید.
- مخلوط واکنش را به شرح زیر آماده کنید:
جزء | حجم (میکرولیتر) |
|---|---|
RNA الگو | تا 1 میکروگرم |
Oligo (dT)18 / پرایمر اختصاصی | 1 |
بافر واکنش (5X) | 4 |
آنزیم Reverse Transcriptase | 0.5 |
dNTP Mixture | 2 |
آب عاری از نوکلئاز | تا حجم نهایی 20 |
- انکوباسیون:
- مخلوط را بهخوبی همگن کرده و در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد به مدت ۶۰ دقیقه انکوبه کنید.
- برای RNA با ساختارهای ثانویه پیچیده، دما را تا ۷۰ درجه سانتیگراد افزایش دهید.
- غیرفعالسازی آنزیم:
- نمونه را در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه حرارت دهید.
- ذخیرهسازی:
- cDNA سنتزشده را در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
استفاده از Random Hexamer:
- آمادهسازی واکنش اولیه:
- نمونه RNA و Random Hexamer را روی یخ ذوب کنید.
- مخلوط واکنش را به شرح زیر آماده کنید:
جزء | حجم (میکرولیتر) |
|---|---|
RNA الگو | تا 1 میکروگرم |
Random Hexamer | 1 |
dNTP Mixture | 2 |
آب عاری از نوکلئاز | تا حجم نهایی 10 |
- انکوباسیون اولیه:
- مخلوط را بهخوبی همگن کرده و در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه انکوبه کنید.
- بلافاصله نمونه را روی یخ قرار دهید.
- افزودن اجزای باقیمانده:
- به مخلوط واکنش اضافه کنید:
- 0.25 میکرولیتر آنزیم Reverse Transcriptase.
- 4 میکرولیتر بافر واکنش (5X).
- آب عاری از نوکلئاز تا حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر.
- به مخلوط واکنش اضافه کنید:
- انکوباسیون نهایی:
- مخلوط را در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد به مدت ۶۰ دقیقه انکوبه کنید.
- غیرفعالسازی آنزیم:
- نمونه را در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه حرارت دهید.
- ذخیرهسازی:
- cDNA سنتزشده را در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.