1. کنترل مثبت و کنترل منفی در PCR چه نقشی در عیبیابی عدم مشاهده باند PCR دارند؟

پاسخ: کنترل مثبت (Positive Control) حاوی یک DNA الگوی شناختهشده است که قطعاً باید محصول PCR را تولید کند. اگر کنترل مثبت هم باند ندهد، مشکل از اجزا یا دستگاه شماست. کنترل منفی (Negative Control) حاوی آب به جای الگو است و نباید هیچ باندی تولید کند. اگر باندی در کنترل منفی دیده شود، نشاندهنده آلودگی است که میتواند راندمان واکنش هدف شما را کاهش دهد.

2. دایمر پرایمر چیست و چگونه بر تشکیل باند PCR تأثیر میگذارد؟

پاسخ: دایمر پرایمر (Primer Dimer) قطعات کوچک DNA (معمولاً زیر 50 جفت باز) هستند که از اتصال دو پرایمر به یکدیگر تشکیل میشوند. این دایمرها در ژل به صورت باندهای کوچک و تیز در پایین ژل ظاهر میشوند. دایمرها با مصرف پرایمرها و dNTPs، مواد لازم برای تشکیل باند PCR هدف را کاهش داده و میتوانند منجر به عدم تشکیل باند هدف یا کاهش شدت آن شوند.

3. آیا میتوانم با DNA تخریب شده، باند PCR تولید کنم؟

پاسخ: اگر DNA الگو تخریب شده باشد، بسته به میزان تخریب و اندازه محصول مورد انتظار، ممکن است نتوانید باند PCR هدف را مشاهده کنید. برای تکثیر قطعات کوچک (زیر 200 جفت باز) ممکن است RNA کمی تخریب شده نیز قابل استفاده باشد، اما برای قطعات بزرگتر، DNA الگو باید دارای یکپارچگی خوبی باشد.

4. غلظت MgCl2 چگونه بر باند PCR تأثیر میگذارد؟

پاسخ: MgCl2 یک کوفاکتور ضروری برای آنزیم DNA پلیمراز است. غلظت خیلی کم MgCl2 میتواند فعالیت آنزیم را کاهش داده و منجر به عدم تشکیل باند PCR شود. غلظت خیلی زیاد نیز میتواند باعث اتصال غیراختصاصی پرایمرها و تولید باندهای ناخواسته شود. بهینهسازی غلظت MgCl2 معمولاً بین 1.5 تا 2.5 میلیمولار است.

5. چرا باید از Master Mixها به جای اضافه کردن جزء به جزء در PCR استفاده کنم؟

پاسخ: Master Mixها تمامی اجزای ضروری PCR (به جز الگو و پرایمرها) را در یک محلول آماده و با غلظت بهینه فراهم میکنند. استفاده از Master Mix باعث کاهش خطای انسانی در Pipetting، افزایش تکرارپذیری بین نمونهها و آزمایشها، و صرفهجویی در زمان میشود. این کار ریسک عدم تشکیل باند PCR به دلیل خطاهای آمادهسازی را به شدت کاهش میدهد.