1. چگونه میتوانم کیفیت RNA خود را قبل از سنتز cDNA ارزیابی کنم؟

پاسخ: برای ارزیابی کیفیت RNA، میتوانید از الکتروفورز ژل آگارز دناتوره کننده استفاده کنید و باندهای 28S و 18S ریبوزومی را بررسی کنید (نسبت شدت 2:1 نشاندهنده یکپارچگی خوب است). روش دقیقتر و کمیتر، استفاده از دستگاههای میکروفلوئیدیک مانند Agilent Bioanalyzer است که “عدد یکپارچگی RNA” (RIN) را ارائه میدهد (عدد بالاتر از 7-8 برای بیشتر کاربردها مناسب است).

2. چه نوع پرایمری برای سنتز cDNA از RNA تخریب شده بهتر است؟

پاسخ: برای RNAهای تخریب شده یا قطعهقطعه شده، پرایمرهای Random Hexamers بهترین گزینه هستند. این پرایمرها به طور تصادفی به نقاط مختلف رشته RNA متصل میشوند و امکان سنتز cDNA را از سراسر طول ترانسکریپت، حتی اگر قطعه قطعه شده باشد، فراهم میکنند. Oligo-dT برای RNAهای سالم و با انتهای پلی-A سالم مناسب است.

3. آیا RNase Inhibitor واقعاً در سنتز cDNA از RNA با کیفیت پایین ضروری است؟

پاسخ: بله، RNase Inhibitor در این شرایط بسیار حیاتی است. حتی RNA با کیفیت پایین نیز ارزش حفظ شدن را دارد. RNase Inhibitor با غیرفعال کردن آنزیمهای RNase که ممکن است در نمونه یا معرفها وجود داشته باشند، از تخریب بیشتر RNA در طول واکنش سنتز cDNA جلوگیری میکند و به بهبود راندمان سنتز کمک شایانی میکند.

4. آیا میتوانم با RNA از نمونههای FFPE cDNA بسازم؟

پاسخ: بله، با راهکارهای مناسب میتوان از RNA استخراج شده از نمونههای FFPE (که معمولاً تخریب شدهاند) cDNA ساخت. استفاده از کیتهای استخراج RNA مخصوص FFPE، استفاده از پرایمرهای Random Hexamers برای سنتز cDNA، و افزایش دمای مرحله رونویسی معکوس برای باز کردن ساختارهای ثانویه، از جمله راهکارهای کلیدی هستند.

5. اگر پس از سنتز cDNA باز هم محصولی نداشتم، چه باید بکنم؟

پاسخ: در این صورت، ابتدا کیفیت RNA اولیه را مجدداً بررسی کنید. اطمینان حاصل کنید که مهارکنندهای در RNA وجود ندارد (با رقیق کردن RNA). سپس، پرایمرهای رونویسی معکوس را بررسی کنید. از فعالیت آنزیم Reverse Transcriptase و سایر اجزای کیت سنتز cDNA مطمئن شوید (با اجرای یک کنترل مثبت). همچنین، افزودن RNase Inhibitor و بهینهسازی دمای رونویسی معکوس را در نظر بگیرید.